|
|
Стволовые клетки - это клетки, сохраняющие потенциал к развитию в разных направлениях. Из стволовой клетки могут возникнуть и кожная, и нервная клетки, и клетки крови [7-11,18,33]. Считалось, что во взрослом организме стволовые клетки отсутствуют, что их существование ограничивается самым ранним периодом эмбрионального развития. Однако в 70-е году А.Я. Фриденштейн с соавторами обнаружили эти клетки в мезенхиме (строме) "взрослого" костного мозга [19]. По принадлежности к строме их в дальнейшем стали называть стромальными стволовыми клетками. В 70-е годы были опубликованы работы, демонстрировавшие наличие стволовых клеток практически во всех органах взрослых животных и человека [3,4]. В связи с этим принято разделять стволовые клетки на эмбриональные стволовые клетки - ЭСК (их выделяют из эмбрионов на стадии бластоцисты) и региональные стволовые клетки - РСК (их выделяют из органов взрослых особей или из органов эмбрионов более поздних стадий). Будучи мультипотентными, стволовые клетки составляют существенный восстановительный резерв в организме и способствуют замещению дефектов, возникающих в силу тех или иных обстоятельств [13,27]. Особое удивление биологов вызвало наличие стволовых клеток в центральной нервной системе. Они отвечают на различные поражения нервной ткани размножением (сами нервные клетки, как известно, утрачивают способность к размножению уже на стадии нейробласта) и дифференцировкой в нервные и глиальные клетки [10-11, 25]. Полагают, что изолированные нейральные РСК способны превращаться и в другие производные [25]. Стволовые клетки как удобная модель для анализа роли генов в процессе дифференцировки. Способность стволовых клеток (как РСК, так и ЭСК) трансформироваться в разных направлениях делает их весьма удобной модельной системой для изучения молекулярно-генетических событий, обусловливающих дифференцировку клеток в разных направлениях. Действительно, стволовые клетки можно изолировать, так сказать, в чистом виде и затем анализировать функции генных сетей на последовательных этапах их дифференциального развития [21]. Оказалось, в частности, что время последовательного включения генов, контролирующих развитие, совпадает в постимплантационных зародышах и в культуре эмбриоидных тел, образованных ЭСК [16,32]. Следовательно, стволовые клетки могут служить удобной экспериментальной моделью для уточнения молекулярно - генетических процессов, сопровождающих клеточную специализацию. Анализ культур стволовых клеток с помощью молекулярно-генетического микроэррэй метода продемонстрировал, что в одном клоне мезенхимных стволовых клеток синтезируется по крайней мере 1200 матричных РНК [39]. В разных стволовых клетках присутствует похожий набор предсинтезированных матричных РНК- копий многих генов [30]. В то же время обнаружено, что по мере дифференцировки стволовых клеток наблюдаются изменения спектра экспрессирующихся генов. Так, оказалось, что 68 генов, специфически активных в прогениторных клетках, слабо или совсем не экспрессируются в нестин-положительных клетках. Дифференциальная активность генов свойственна также развитию нейросфер. В них, в частности, прослежена динамика активности генов, ответственных за клеточнй рост, рост клеточных отростков, синаптогенез, за про- и антиаптознуюпрограммы (34, 41, 43). При этом удалось выяснить, что, как и случае дифференцировки в составе целостного эмбриона [7,9], в мезенхимных стволовых клетках взрослой гематогенной ткани содержится практически весь набор матричных РНК, которые функционируют в зародышевых листках и на стадии органогенеза. Идентифицированы также матричные РНК ключевых генов, регулирующих созревание клеток мезенхимального и мезодермального происхождения, а также энто- и эктодермы. Большинство матричных РНК HOX-генов присутствует уже в яйцеклетке и презумптивных зародышевых клетках [16,17, 31]. Следовательно, в стволовых клетках проявляется общий принцип онтогенеза - функция генов с "опережением", т.е. синтез тех матричных РНК, которые будут "нужны" (будут "работать") на стадиях развития, порою значительно более поздних. Гены-господа, проблема дифференцировки и стволовые клетки Полученные данные позволят уточнить организацию соответствующих генных сетей, что в условиях целостного организма иногда не так-то просто. В частности, представляется возможность выявить пути взаимодействия так называемых генов-господ и генов-рабов. Под первыми подразумевают ключевые гены, от которых зависит специфика развития данной ткани или органа. Под вторыми - запускаемые генами-господами каскады структурных генов, обеспечивающих синтез тканеспецифических белков и соответственно формирование того или иного органа или ткани. Использование стволовых клеток в биологии развития позволило подтвердить предположение о существовании генов-господ, которые включают каскады генов, от которых зависит специализация целых органов, зародышевых листков и отдельных типов клеток [5, 16-17]. Эта закономерность является универсальной и присуща всем животным. Так, у дрозофилы есть ген eyeless (безглазости), который обусловливает развитие глаза. Если его заставить "работать" в необычном месте, то можно индуцировать развитие глаза на брюхе, на лапках, на крыле и в любом другом месте. Сходный ген есть и у млекопитающих, там он называется Pax6. Если ввести его в геном дрозофилы, он будет давать тот же эффект, что и собственный ген хозяина, что свидетельствует об универсальности эффекта генов-господ [14]. Ген pdf-1 является "триггером" программы, запускающей развитие поджелудочной железы, а ген НОХ-11 "отвечает" за развитие селезенки, ген Crypto - за развитие сердца, мутации гена НОХD13 вызывают полидактилию верхних и нижних конечностей у человека [16]. Известны гены-господа и для развития отдельных зародышевых листков. Так,
мутация гена casanova блокирует развитие всей энтодермы, а генов Brachiury
и zeta-globin - всей мезодермы [32]. Можно предполагать, что определенную регулирующую роль в дифференцировке стволовых клеток играют повторяющиеся последовательности, например, микро- или минисателлитные. Во всяком случае в работах О.В.Подгорной [35] было показано существование белков, специфически свяэывающихся с тандемными повторами, что определяло особенности трехмерной организации хроматина. Как известно, от этой организации зависит специфика функционирования генов и, следовательно, состояние системы повторяющихся последовательностей, их недорепликация, диминуция или гиперрепликация могут играть существенную роль в специфической дифференцировке стволовых клеток Естественно, эта проблема заслуживаеи особого внимания и изучения.. Очевидно, регуляция индивидуального развития осуществляется иерархически организованной системой генных сетей [21], и пониманию особенностей этой регуляции могут существенно помочь стволовые клетки. Большой интерес представляет в связи с этим реконструкция органных структур in vitro на основе стволовых клеток. Томоока с соавторами [38] удалось получить из стволовых нервных клеток структуры, подобные нервной трубке. Сходные опыты с диссоциированными клетками гиппокампа поставил в Институте мозга РАМН И.В.Викторов, предпринимаются попытки выращивания клеток в специальных колонках с целью получения органоподобных структур и использования их в клинике [17]. Такого рода исследования весьма перспективны как для решения фундаментальных задач, так и для использования в практике для целей генной и клеточной терапии. Проблема трансдетерминации и трансдифференцировки и стволовые клетки В связи с необычайно широким проспективным потенциалом стволовых клеток возникает путаница с понятиями трансдетерминации и трансдифференцировки, что чревато размыванием принятых в гистологии и эмбриологии терминологических правил и созданием почвы для бесплодных дискуссий и спекуляций. Действительно, если трансформации стволовых и прогениторных клеток в разных направлениях обозначить как трансдифференцировку (а некоторые авторы позволяют себе такую вольность), будут необоснованно разрушены представления о стабильности и необратимости процессов дифференцировки, что ведет к невообразимой путанице. На самом деле для ниспровержения существующих взглядов нет никаких оснований. Совершенно очевидно, что когда клетка теряет способность к пролиферации и вступает на путь развития в определенном направлении, например, нейробласта, она не способна дать начало другим производным. Добиться репрограммирования ядра не так-то просто. Оно достигается лишь его пересадкой в другую цитоплазму (в частности, при получении гетерокарионов или в опытах с пересадкой ядер), и то не всегда успешно [см 14] . Надежно зарегистрированные случаи трансформации стволовых и прогениторных клеток [обз. 3-4, 17-18] являются в действительности не трансдифференцировкой, а так называемой трансдетерминацией, т.е. переключением детерминации с одного пути на другой. Этот феномен давно известен в экспериментальной эмбриологии [26]. Описанное в ряде работ "превращение" глиальной клетки в нейрон [см 16] объясняется, по-видимому, гетерогенностью популяции глиоцитов, так что некоторые из них могут сохранять свойства камбиальности, а порою и "стволовости". В таком случае обнаруженный феномен удивления не вызывает. Одна из важнейших общебиологических проблем, решить которую поможет изучение стволовых клеток - генетический механизм поддержания состояния детерминированнности в ходе пролиферации клеток и выхода из пролиферации в дифференцировку. Всерьез она была поставлена еще Эрнстом Хадорном [26], но до сих пор не получила решения. Недавно удалось пролить некоторый свет на молекулярно - генетические события в случае перехода клетки из детерминированного состояния в дифференцированное. Оказалось, что существенное значение имеют при этом взаимоотношения стволовых клеток с клетками-"нишами", к которым "прилежат" стволовые клетки. Оказалось, что в семенниках у дрозофилы соматические клетки "хаба", формирующие нишу стволовых клеток, являются источником лиганда udp, который активирует так называемый Jak-Stat сигнальный каскад. Повышение уровня экспрессии лиганда udp в клетках апикального района семенников достаточно для увеличения популяции как репродуктивных, так и стволовых соматических клеток семенника. Функционирование компонентов Jak-Stat сигнального каскада, киназы Нор и транскрипционного активатора Stat92E, необходима для поддержания обоих типов стволовых клеток в семенниках дрозофилы. Это функционирование поддерживается благодаря передаче стволовым клеткам фактора udp клетками-"нишами", потому разрыв связи между ними и стволовыми клетками обусловливает выход последних в дифференцировку [40]. Насколько универсален этот механизм, предстоит еще выяснить. Стволовые и камбиальные клетки При столь пристальном внимании к стволовым клеткам немудрено придание забвению термина "камбиальные клетки". На Западе их теперь называют transit amplifying cells, т.е. рассматривают как некую преходящую фазу развития, а не как самостоятельную популяцию клеток как это было принято раньше. Иногда о них вообще забывают. А между тем восстановительные процессы в тканях протекают при их непосредственном участии - наглядный тому пример клетки росткового слоя кожи, пополняющие постоянно расходуемый запас зрелых клеток кожного покрова. Более того, до открытия стволовых клеток речь шла только о таком способе репарации. В нервной ткани камбиальных нервных клеток, сохранивших способность к размножению, нет (о глии речь не идет), но там сохраняется резерв нейробластов, посредством своей дифференцировки способных восполнить возникающие при различных формах патологии дефекты, сохраняя тем самым функциональную дееспособность соответствующего отдела мозга или периферической нервной системы [6, 10-11]. В этом случае встает чрезвычайно важный вопрос о взаимоотношении стволовых и камбиальных клеток [10-11]. Возможны ли их взаимопревращения, Может ли региональная стволовая или прогениторная клетка дать начало камбиальной и, наоборот, имеет ли место этот процесс в целостном организме, каково его значение для нормального течения восстановительных процессов и каков (если он существует) его молекулярно-генетический механизм. Решение этой проблемы имеет важное не только фундаментальное, но и практическое значение. Исследование стволовых клеток в разных экспериментальных условиях, бесспорно, поможет этому решению и позволит представить в новом свете тонкие механизмы восстановительных процессов, протекающих в организме. Работы подобного рода уже начаты, в частности, на примере стволовых клеток эпителиального покрова кожи. Результаты, свидетельствующие по крайней мере о "порождении" камбиальных клеток стволовыми впечатляющи, но нередко противоречивы и дают повод для дискуссий [23-24, 28]. При этом следует учитывать и такое явление как "перекрытие" программ, реализуемых в ходе клеточной специализации, так что в фазу протодифференцировки включается с разной степенью эффективности несколько разных программ развития, и еще не дается однозначное решение клеточной судьбы. Например, дифференцирующийся в катехоламинэргическом направлении нейробласт характеризуется не только синтезом матричных РНК (мРНК), продуцирующих компоненты катехоламинзргической системы, но и существенно более слабым синтезом матричных РНК, способных продуцировать компоненты холинэргической системы. Если в определенный момент развития сменить "катехоламинэргическую" мишень, иннервируемую данной клеткой, на "холинэргическую" мишень, синтез "катехоламинэргических" мРНК начнет тормозиться и возобладает синтез "холинэргических" мРНК. В результате произойдкт как бы передетерминация клетки на новый путь развития с развертыванием иной программы [12]. Стволовые клетки, которые порою находят в шиповатом слое эпидермиса кожи, как раз и могут быть "мигрантами" из эпидермального очага стволовых клеток. Мне доводилось встречать такие клетки в дифференцирующейся автономной нервной системе эмбрионов человека [8]. Важную роль в подобных случаях играет микроокружение клеток, которое оказывает существенное влияние на направление процесса детерминации и дифференцировки. Иными словами, ситуация с "превращениями" стволовых клеток и их взаимоотношениями с камбиальными клетками далеко не так проста, как это может показаться на первый взгляд. Она осложняется еще и проблемой с маркерами, специфически "метящими" стволовые клетки и их производные. В частности, при 10% стволовых клеток в базальном слое эпителия кожи 40% этого содержат белок бета1-интегрин, используемый в качестве специфического маркера стволовых клеток кожи. В связи с этим сообщения о взаимопревращениях и трансформациях стволовых клеток требуют серьезной экспериментальной проверки. Стволовые клетки и проблемы генной и клеточной терапии Плюри - и мультипотентность стволовых клеток делает их идеальным материалом для использования в трансплантационных методах клеточной и генной терапии [1-2, 3-4,18]. При этом следует учитывать то, что наряду со стволовыми клетками, которые при повреждении тканей соответствующего органа мигрируют к зоне повреждения, делятся и дифференцируются, образуя в этом месте новую ткань, существует и "центральный склад запчастей" - стромальные клетки костного мозга. Эти клетки универсальны, они, по-видимому (полученные многочисленные данные такого рода все же требуют дополнительной проверки), способны поступать с кровотоком в поврежденный орган или ткань, и на месте под влиянием различных сигнальных веществ дают начало нужным специализированным клеткам, которые замещают погибшие. В частности, установлено, что введение стромальных клеток костного мозга в зону повреждения сердечной мышцы (зону инфаркта) устраняет явления постинфарктной сердечной недостаточности у экспериментальных животных. Так, стромальные клетки, введенные свиньям с экспериментальным инфарктом, уже через восемь недель полностью перерождаются в клетки сердечной мышцы, восстанавливая ее функциональные свойства. Результаты такого лечения инфаркта впечатляющи. По данным Американского кардиологического общества за 2000 год у крыс с искусственно вызванным инфарктом 90% стромальных клеток костного мозга, введенных в область сердца, трансформируется в клетки сердечной мышцы. Японские биологи получили в лабораторных условиях из стромальных клеток костного мозга мышей клетки сердечной мышцы. В культуру стромальных клеток добавляли 5-азоцитидин, и они начинали дифференцироваться в клетки сердечной мышцы. Такая клеточная терапия весьма перспективна для восстановления сердечной мышцы после инфаркта, поскольку для нее используются собственные стволовые стромальные клетки. Они не отторгаются, - кроме того, при введении взрослых стволовых клеток исключена вероятность их злокачественного перерождения. Широко используется терапия стромальными клетками в ортопедии. Это связано с существованием особых белков, так называемых ВМР (костные морфогенетические белки), которые индуцируют дифференцировку стромальных клеток в клетки костной ткани - остеобласты. Клинические испытания в этом направлении дали многообещающие результаты. Например, в США 91-летней пациентке с незаживающим в течение 13 лет переломом вживили специальную коллагеновую пластинку с нанесенными на нее ВМР. Поступающие в зону перелома стромальные клетки "притягивались" к пластинке и под влиянием ВМР превращались в клетки костной ткани. Через 8 месяцев после установки такой пластинки сломанная кость у больной восстановилась. Сейчас в США проходят испытания и скоро начнут широко применяться в клинике специальные пористые губки, наполненные одновременно и стромальными клетками и нужными индуцирующими веществами, направляющими развитие клеток по требуемому пути. Большое значение придают стволовым клеткам (и, в частности, стромальным) при лечении различных нейродегенеративных и неврологических заболеваний - паркинсонизма, болезни Альцгеймера (старческое слабоумие), хореи Гентингтона, мозжечковых атаксий, рассеянного склероза и др. Группа неврологов из Американского национального института неврологических заболеваний и Стэнфордского университета обнаружили, что стромальные клетки костного мозга могут дифференцироваться в нейральном направлении. Следовательно, костный мозг человека может быть использован в качестве источника стволовых клеток для восстановления поврежденных тканей в головном мозгу. Возможна также трансформация этих клеток в печеночные, почечные, в клетки, синтезирующие инсулин, что может быть использовано для лечения диабета. Следовательно, пациент может стать собственным донором, что предотвратит реакцию иммунологической несовместимости тканей. Группа ученых под руководством Евы Мизей полагает, что стволовые клетки, куда бы они ни имплантировались, могут достигать поврежденного места, в частности, мозга и обеспечивать там восстановительные процессы. Так, после внутривенного введения взрослым мышам стромальных стволовых клеток, различные нейральные производные были ими обнаружены во многих областях мозга, включая неокортекс, гиппокамп, таламус, ствол мозга и мозжечок. Предпринимаются успешные попытки разработать методы клинического использования стволовых клеток пуповины и плаценты [37]. В связи с этим отпадает необходимость так называемого терапевтического клонирования, с этической точки зрения весьма сомнительного. Кроме того появились многочисленные работы, в которых показано, что в трансплантированных ядрах соматических клеток функции не менее 4% генов существенно нарушены. Выяснилось также, что по крайней мере в настоящее время не удается добиться полного репрограммирования ядер соматических клеток (необходимого для нормального индивидуального развития) при помещении их в другую цитоплазму. Не удается "стереть" метилирование ряда генов. В результате необходимая для нормального развития зародышей нормальная их функция не восстанавливается. Следовательно, такие ядра неспособны обеспечить развитие физически полноценных зародышей. Особенно существенно то, что в трансплантированных ядрах соматических клеток не удается полностью реактивировать гены, родственные Oct4, одному из главных маркеров эмбриональных стволовых клеток, которые, собственно, и планируется использовать в качестве материала для "запчастей" (22, 42). Надлежит, очевидно, искать способы преодолеть эти трудности на экспериментальных моделях. Важной является также проблема сохранения жизнеспособности стволовых клеток при их трансплантации. Она может быть повышена путем введения в геном трансплантируемых нейронов генов ростовых нейротрофических факторов, что является защитой от апоптоза. Такого рода попытки предпринимаются в различных лабораториях США и Европы. В нащих работах (Институт биологии гена РАН, Институт биологии развития РАН, Институт акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН) выделены региональные нейральные стволовые клетки, дана их подробная иммуногистохимическая характеристика, в том числе на проточном флюориметре, что было сделано в таких масштабах впервые. В опытах с трансплантацией стволовых нейральных клеток человека в мозг крыс была показана их приживляемость, миграция на достаточно большие расстояния (несколько миллиметров) и способность к дифференцировке. Последняя в значительной степени определяется микроокружением, в которое попадает трансплантат. Так, при трансплантации нейральных стволовых клеток человека, в ту область мозжечка крысы, где расположены клетки Пуркинье, они дифференцируются в направлении именно этого типа клеток, о чем свидетельствует синтез в них белка калбиндина, специфического продукта клеток Пуркинье [1-2, 10, 14]. Российскими биологами (Институт биологии гена РАН, Харьковский институт криобиологии и фирма "Вирола") впервые разработана оригинальная методика индукции в культуре стволовых стромальных клеток дифференцировки в направлении клеток, подобных клеткам островков Лангерганса, синтезирующим инсулин. Синтез этого белка был продемонстрирован с помощью современных методов молекулярной биологии и цитологии. Интересно, что эти клетки формируют в культуре структуры, напоминающие островки Лангерганса. Они могут быть использованы для лечения диабета [20]. Важным достижением российских ученых является также доказательство того, что белки теплового шока блокируют образование глиального рубца при нейротрансплантации, в связи с чем представляется возможным трансформировать подлежащие трансплантации клетки, введя в них ген, кодирующий белок теплового шока под промотором, реагирующим на температуру тела млекопитающих. Таким промотором иожет быть промотор дрозофилы, контролирующий работу этого гена. Сотрудниками Института биологии гена и Института биологии развития обнаружено, что поставленные под этот промотор гены, кодирующие нейротрофические факторы человека, активно функционируют в эмбрионах трансгенных дрозофил и в ксенотрансплантатах эмбриональных стволовых нейральных клеток дрозофилы в мозгу крысы. Как показано в совместных исследованиях Института биологии гена РАН и Института физиологии им. Н.П.Павлова РАН, в мозгу трансгенных взрослых мух эти гены экспрессируются главным образом в области центрального тела, ответственного за процессы обучения. В связи с этим решается задача создания генно-инженерной системы и соответствующих конструкций, основанных на использовании регуляторных элементов генома дрозофилы, способных обеспечить активацию трансгенов в условиях температуры тела млекопитающих [10]. На основе этих исследований станет возможным создание генно-инженерных
конструкций для трансформации стволовых клеток, подлежащих трансформации.
Такого рода трансформации будут способствовать лучшему приживлению трансплантата,
повышению его жизнеспособности и спецификации составляющих его клеток
[7-11]. Изменились ли принципиально наши представления о клеточной дифференцировке с открытием стволовых клеток? Вопреки утверждению некоторых авторов пока что нет. Действительно: 1.Как уже отмечалось, дифференцировка самых разных стволовых клеток происходит по тем же законам, что были сформулированы для клеточной дифференцировки вообще. И в этом, кстати, заключается ценность стволовых клеток как модельной экспериментальной системы. 2. С выходом клетки, в том числе и стволовой, в дифференцировку утрачивается ее способность к делению, по крайней мере на стадии терминальной дифференцировки и прилежащих к ней стадиях. 3.Исследование поведения стволовых клеток не поколебало представлений о стабильности и необратимости клеточной дифференцировки. Мы по-прежнему можем утверждать, что из фиброцита, плазматической клетки или из париетальной клетки желудка никогда не получится нейрон, а из нейрона не возникнет кожная клетка. Тезис, что стволовая клетка способна к разного рода трансформациям никак не нарушает это правило, а лишь демонстрирует лишний раз, что ранним эмбриональным клеткам свойственна мультипотентность. На стадии терминальной дифференцировки клетка обретает стабильное состояние и становится неспособной к разного рода превращениям. Описываемые некоторыми авторами случаи такого рода относятся либо к давно известному феномену трансдетерминации, либо к артефактам. Что же в таком случае нового привнесло в биологию открытие стволовых клеток во взрослом организме? Оно изменило наши представления об организации тканей и о механизмах восстановительных процессов, в них протекающих. Был сделан новый и очень важный вывод о том, что эмбриональные клетки с высоким потенциалом к развитию сохраняются и во взрослом организме. Более того, они составляют важнейшее звено в цепи репаративных процессов, о чем ранее не подозревали. В 70-е годы мною были описаны эмбриональные клетки в печени взрослой мыши (в книге "Взаимодействие генов в развитии",М., Наука, 1977). Однако, опираясь на существующие тогда взгляды, я не предполагал, что они обладают столь высоким потенциалом к развитию и принимают активное участие в репаративном процессе. Открытие стволовых клеток повлекло необходимость замены существовавшей до сих пор схемы репаративных процессов в тканях Камбиальная Дифференцирующаяся Зрелая В ходе клеточного деления стволовых и камбиальных клеток возникают материнская и дочерняя клетки. Материнские клетки используются для самоподдержания популяции, а дочерние в случае стволовых "выходят" либо в стволовую клетку, либо непосредственно в дифференцировку, а в случае камбиальных - непосредственно в дифференцировку. На стадии камбиальной клетки сохраняются свойства ранних эмбриональных клеток развиваться в разных направлениях, на стадии камбиальной клетки эта способность утрачивается, они производят лишь региональные структуры. При исследовании стволовых клеток следует также учитывать и еще одну,
недавно обнаруженную и существенную особенность. Оказалось, что нейральные
прогениторные клетки и глия, происходящие из стволовых клеток вентрикулярной
зоны ЦНС часто оказываются анэуплоидными. Около 33% таких клеток, делящихся
в субвентрикулярной зоне, утрачивают хромосомы in vivo. При этом, естественно,
могут наблюдаться специфические изменения экспрессии генов вследствие
утраты гетерозиготности. Понятна необходимость тщательного исследования
тех последствий, которые вызываются вышеозначенным процессом (29,36). ЛИТЕРАТУРА 1. Александрова М.А., Павлова Г.В., Ревищин А.В. и др. // Генетика.
2000. Т. 36, N 11. С. 1553-1560. |
